وتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیک در انسان می‌باشند. بیماریهای ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری بهنظر میرسد.
روشهای مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد که شامل: روش‌های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیکی و مولکولی (از جمله PCR) است. تمام این روشها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گرانقیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.
هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی میباشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و بهجای دستگاههای گرانقیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوک حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد 60 درجه سانتیگراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژنها در زمان کوتاهتری به تشخیص اختصاصی این باکتری سالمونلا پرداخت.
این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با کاربرد گسترده در آزمایشگاههای تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاههای مناطق محروم و آزمایشگاههای سیار مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP
فصل اول
مقدّمه (اهداف تحقیق)

مقدمه
اعضای جنس سالمونلا، باکتری گرم منفی، میلهایی، بیهوازی اختیاری و بدون اسپور هستند. از آنجا که جایگاه اصلی و طبیعی این باکتری‌ها روده انسان و حیوانات می‌باشد اصطلاحاً آنها را باسیل‌های روده‌ای یا انتریک می‌نامند. از لحاظ شرایط رشد این میکروارگانیسم‌ها باکتری‌های انعطاف‌پذیری بوده و به آسانی با شرایط محیطی خود را هماهنگ می‌کنند این جنس از میکروارگانیسم‌ها به حرارت حساس‌اند. در درجه حرارت‌های پائین امکان بقای آنها بیشتر است .(Connie & Manuselis, 2000)
اکثر سروتیپ‌های سالمونلا پاتوژن‌های بالقوه برای انسان و بسیاری از حیوانات می‌باشند. این باکتری‌ها در دستگاه گوارش مهره‌داران اعم از پستانداران و پرندگان و خزندگان و ماهی‌ها سیطره پیدا کرده، بسته به سروتیپ، شرایط و عوامل متعدد میزبانی، بیماریهایی با نشانه‌های گوناگون و عوارض متفاوت ایجاد می‌کنند .(Merchant & Pocker, 1983)از جمله باکتریهای رودهایی هستند که موجب بیماری تب تیفوئید(حصبه)، تب شبه حصبه و بیماریهای ناشی از مواد غذائی در انسان میگردند(Jay et al., 2005).
بیماریهای ناشی از آلودگی مواد غذائی ناشی از سالمونلا را non typhoidal نامیدهاند. سالمونلا بهطور گستردهایی در محیط زیست از قبیل آب، خاک و مدفوع حیوانات توزیع شده است (Cidrp, 2009). باکتری معمولاً از طریق مدفوع انسان و یا دام دفع شده و باعث آلودگی آب و غذا و محیط می‌گردد. مواد غذائی مانند گوشت، تخممرغ، مرغ، سس مایونز، سبزیجات و غیره ،از ناقلهای اولیه عفونت سالمونلا به انسان هستند(Dolye & Beuchat, 2007)..
سالمونلای غیرتیفوئیدی علت اصلی بیماریهای ناشی از مواد غذائی در سراسر جهان است. که برآورد شده که حدود 4/1 میلیون مورد در سال مورد عفونت غذائی سالمونلا قرار میگیرند(Mead et al., 1999).
از اینرو شناخت و تشخیص به موقع سالمونلا از اهمیت خاصی برخوردار است. با ذکر تمامی این موارد به نظر می‌رسد تشخیص به موقع و کنترل باکتری از وظایف مهم آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی است. امروزه از 3 روش رایج به تشخیص باکتری می‌پردازند:
ـ روش‌های کشت سنتی و آزمایشات بیوشیمیایی.
ـ روش‌های سرولوژیکی.
ـ روش‌های مولکولی.
برای تشخیص استفاده از روشهای سنتی مبتنی بر محیط کشت قابل قبول است ولی وقتگیر است و برای تایید جواب نهایی چند روز بهطول میانجامد .(Andrews & Hammack, 2007) علاوهبر این، روشهای ایمنولوژیک مانند الایزا وIMS نیز برای شناسائی سالمونلا توسه یافتهاند.
. (Mansfield & Forsythe, 2000 ; FAVRIN , 2001) با اینحال اختصایت کم و هزینههای بالا، استفاده ازین روشها را محدود کرده است. اخیرا روشهای مولکولی مانند PCR و real time PCR بهطور گسترده در شناسائی سالمونلا استفاده میشوند که روشهایی کارآمد و حساس هستند.
Krascsenicsova et al., 2008) ; Eriksson & Aspan, 2007).
با اینحال این روشها نیازمند سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاههای گرانقیمتاند. ازاینرو نیاز به یک روش دقیق، حساس، آسان و بهصرفهتر است. در سال 200 یک گروه ژاپنی یک روش تشخیص مولکولی به نام LAMP را معرفی کردند .(Notomi et al., 2000)از آن زمان روش LAMP به عنوان یک روش اختصاصی، حساس و سریع برای شناسائی پاتوژنهای ناشی از مواد غذائی مورد استفاده است. یک روش ساده، بدون نیاز به سیکل حرارتی اختصاصی و دستگاههای گرانقیمت و به آسانی قابل اجرا است(Hara-Kudo et al., 2005; Notomi et al., 2000).
هدف این تحقیق شناسائی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد سبزیجات و سس مایونز آلوده با استفاده از روش LAMP، بهعنوان روشی سریع، حساس و اختصاصی میباشد.
اهداف تحقیق در نگاه اجمالی
1. طراحی و بهینهسازی روش LAMP بر اساس ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
2. تعیین حد حساسیت روش PCR و LAMP به روی ژن تهاجمی invA سالمونلا تیفی
3. مقایسه دو روش PCR و LAMP
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده

1-2- مشخصات جنس سالمونلا

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-1-2- تاریخچه
در سال 1885 یک دامپزشک آمریکائی به نام دانیل المر سالمون برای اولین بار این باکتری را از خوک جدا کرد وآن را باسیلوس کلراسوئیس1 نامید. در سال 1888 جرم دیگری توسط گارتنر از فردی که در اثر گاستروانتریت ناشی از مصرف گوشت نپخته مرده بود جدا شد و آنرا باسیلوس انتریتیدیس نامید که بعداً سالمونلا انتریتیدیس خوانده شد. در سال 1900 خواص این باکتری توسط فردی به نام لینیر بهطور رسمی تصویب گردید. از آنجا که این ارگانیسم ها شبیه به باکتری های جدا شده توسط سالمون بودند، به همین جهت به افتخار کاشف اولیه این باکتری سالمونلا2 نامیدند(Roumagnac et al., 2006).
در فاصله بین سالهای 1925ـ1900 بزرگترین رویداد در کشف سرولوژیکی آنتی‌ژن‌های سوماتیک و فلاژلا در مورد گروه سالمونلا بوسیله لیگنیرز انجام شد. در سال 1926 ترکیبات پادگنی سالمونلا طبقه‌بندی گردید و جدولی به نام جدول کافمن ـ وایت ایجاد شد. در حال حاضر این جدول دارای حدود 2500 سروتیپ است (Bhatia & Nabb , 1980) .
سالمونلا بطور گسترده در طبیعت توزیع شده است مانند آب آلوده، خاک حاوی مدفوع حیوانات و غیره. به طور عمده این باکتریها در رودهی حیوانات ساکن است و مخزن اصلی آلودگی مرغ، تخم مرغ، دام، حیوانات خانگی و خزندگان است(Cidrp, 2009).
2-1-2- خواص شکلی
اعضای جنس سالمونلا باکتریهای میلهای شکل و اندازهی آن 5-2 ?5/1-7 /. میکرون بوده است.گرم منفی، بدون اسپور و متعلق به خانوادهی انتروباکتریاسهاند (J. Antonio , 2009 ; Dolye & Beuchat, 2007) .. اکثر اعضای این جنس متحرک و با تاژهی پریتریشاند بهجز چند مورد استثناء مانند سالمونلا گالیناروم3 و سالمونلا پولوروم4 (et al., 2005 Hara-Kudo).
3-1-2- خواص بیوشیمیایی
اعضای این جنس قادر به تخمیر گلوکز بوده ولی از تخمیر ساکارز و لاکتوز ناتوانند. بیشتر انواع سالمونلا ها گلوکز، مالتوز، مانیتول، دولسیتول، دکسترین و سوربیتول را تخمیر می کنند و اسید و گاز بوجود می آورند. اکثر سویهها H2sرا از منبع سولفوری معدنی تولید کرده و تولید H2S یکی از واکنش های کلیدی در تشخیص سالمونلاها میباشد. به استثنای سروتیپ تیفی5 در بیشتر موارد جدا شده از گلوکز گاز ایجاد میکنند. در سیترات به عنوان تنها منبع کربن رشد میکنند اما برخی از گونه ها مانند سالمونلاتیفی و سالمونلا پاراتیفی A سیترات منفی هستند Aksoy, 2004)). این باکتری اکسیداز منفی و کاتالاز مثب